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產品名稱:

五種致瀉性大腸埃希氏菌鑒定試劑盒PCR法

產品型號: 96T 產品時間: 2022-04-24
五種致瀉性大腸埃希氏菌鑒定試劑盒PCR法可針對食品、飼料等樣品中的致病微生物的特異核酸片段進行擴增,儀器實時監測擴增過程中的熒光信號變化,自動判讀結果。本產品用于致瀉大腸埃希氏菌的檢測。檢出限為 103 CFU/ml。

產品概述

五種致瀉性大腸埃希氏菌鑒定試劑盒PCR法

u  產品說明

五種致瀉性大腸埃希氏菌鑒定試劑盒PCR法可針對食品、飼料等樣品中的致病微生物的特異核酸片段進行擴增,儀器實時監測擴增過程中的熒光信號變化,自動判讀結果。本產品用于致瀉大腸埃希氏菌的檢測。檢出限為 103 CFU/ml。

    產品組成(96 測試)

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   所需儀器

ABI ,BioRad,TaKaRa PCR 擴增儀,電泳儀,凝膠成像儀等電泳配套設備。使用熒光定量 PCR 儀進行定性判讀時則無需電泳設備

   自備耗材和儀器

①滅菌 1.5mL 2.0mL 離心管;②冰盒;③移液器0.5-10μL,10-100μL,100-1000μL及配套滅菌吸頭;④ 離心機;⑤渦旋混勻器;⑥金屬浴。

   樣品處理

參照《GB4789.6—2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗致瀉大腸埃希氏菌檢驗》中的操作步驟進行前增菌。建議使用試劑配套細菌基因組 DNA 提取系列產品。

   實驗操作

1.試劑配制(試劑配制區,放置于冰盒中進行取出各管試劑,將試劑*解凍,離心 30s。取 12×(所待檢樣品數+3)PCR 反應管,按 12 個一組排列并編號,依次向各管中加入 23μL 12 種反應液。

2.添加模板(樣本制備區,放置于冰盒中進行向每管反應液中分別加入 2μL 模板(或直接使用無菌吸頭挑取少許待檢菌落至反應管中)。加樣示例:(有 N 個待測樣品

(N+3)12 個一組的反應管,按順序第一組 12 管中全部加入 2μL NG-DW,第二組 12管中全部加入 2μLNG-Ecoli,第三組 12 管中全部加入 2μL 的樣品 1 模板,第四組 12 管中全部加入 2μL 的樣品 2 模板,…,最后12 管中全部加入 2μL PG-Ecoli。

蓋好 PCR 管蓋后,渦旋混勻 30s,離心 1min,立即進行 PCR 擴增反應。

3.擴增反應(擴增及產物分析區

按下列條件設置擴增反應:(如需使用熒光法進行檢測請選擇 FAM 通道

PCR 循環

熒光收集位點

37

10 分鐘

1 個循環

95℃

10 分鐘

1 個循環

95℃

30

 

30 個循環

63 ℃

30

72℃

90

72℃

5 分鐘

1 個循環

 

4.產物電泳(擴增及產物分析區

稱量 4. 0g 瓊脂糖粉,加入至 200 mL 1×TAE 電泳緩沖液中,充分混勻。使用微波爐反復加熱至沸騰,直到瓊脂糖粉*融化形成清亮透明的溶液。待瓊脂糖溶液冷卻至 60右時,加入溴化乙錠( EB )至終濃度為 0.5μg/mL, 充分混勻后,輕輕倒入已放置好梳子的模具中,凝膠長度要大于 10cm,厚度宜為 3mm~5mm。檢查梳齒下或梳齒間有無氣泡,用一次性吸頭小心排掉瓊脂糖凝膠中的氣泡。當瓊脂糖凝膠*凝結硬化后,輕輕拔出梳子,小心將膠塊和膠床放入電泳槽中,樣品孔放置在陰。向電泳槽中加入 1×TAE 電泳緩沖液,液面高于膠面 1mm~2mm。將5μL PCR 產物與 1μL 6×上樣緩沖液混勻后,用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下膠孔,小心上樣于孔中;陽性對照的 PCR 反應產物加入到最后一個泳道;第一個泳道中加入 2 μ L 分子量 Marker 。接通電泳儀電源,根據公式電壓=電泳槽正負極間的距離(cm×5V/cm 計算并設定電泳儀電壓數值;啟動電壓開關,電泳開始以正負極鉑金絲出現氣泡為準。電泳 30min~45min 后,切斷電源。取出凝膠放入凝膠成像儀中觀察結果,拍照并記錄數據。

u  可使用 Gold view、Gal-Rad 等等效的核酸熒光染料替代 EB。

u  推薦使用 DNA MarkerDL2000 100bp ladder,等可指示 100bp~1500bp 條帶的 Marker。

    結果分析

1.陰陽性判讀:

進行電泳檢測時,需對比 Marker 進行判斷,當目的靶標對應位置出現單一顯著條帶時可判斷該靶標為陽性; 否則為該靶標檢測為陰性。使用熒光定量 PCR 儀檢測時,檢測孔Ct≤30 時判斷該孔為陽性;當檢測孔Ct30 時, 該檢測孔為陰性

示例電泳圖

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2.有效性判讀:

需同時滿足:1.空白對照中所有泳道均為陰性;2.陰性對照中 uidA 泳道陽性,其余泳道陰性;2.陽性對照中所有泳道陽性,此時可判斷實驗有效。如無法滿足上述條件,則實驗無效,需重復實驗;如重復后結果仍為無效,請于本公司技術支持聯系。

3.結果判讀:

在實驗有效的情況下,可根據下表進行判讀:

 

大腸埃希氏菌類別

目標條帶的種類組合

EIEC

ipaH(+)

 

 

uidA

(+/-)

EAEC

aggR,astA,pic 中一條或一條以上陽性

EPEC

bfpB,eae(+,stx1stx2,

STEC/EHEC

stx1,stx2 中一條或一條以上陽性,eae+/-,bfpB-)

ETEC

lt,stp,sth 中一條或以上陽性

u  97%以上大腸埃希氏菌為 uidA 陽性,可參考陰性對照中該基因檢測結果判斷擴增效果;

u  當結果判定為EPEC 陽性時,若 bfpB 靶標為陽性則說明樣品含有典型EPEC;若 bfpB 靶標為陰性則說明樣品為非典型EPEC;

當結果判定為STEC/EHEC 陽性時,若 eae 靶標為陽性則說明樣品含有典型EHEC;若 eae 靶標為陰性則說明樣品為非典型EHEC。


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